肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (23): 4272-4278.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.013

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞

杜晶春¹，朱蕊²，范婷婷¹，王鹏鲲¹，林勇平¹，徐霞¹

1广州医学院第一临床学院检验系，广东省广州市 510182
2广州医学院第一附属医院妇产科，广东省广州市 510120

出版日期:2013-06-04 发布日期:2013-06-04
通讯作者: 徐霞，教授，硕士生导师，广州医学院第一临床学院检验系, 广东省广州市 510182 xuxia503@126.com
作者简介:杜晶春，男，1979年生，河南省信阳市人，汉族，2010年中山大学毕业，讲师，目前主要从事干细胞的分化机制及临床应用方面的研究。 hndjc@yahoo.com.cn
基金资助:
国家自然科学青年基金项目(81101730)；广州医学院第一附属医院院级课题(Y201013)。

Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand modified human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells

Du Jing-chun¹ , Zhu Rui², Fan Ting-ting¹ , Wang Peng-kun¹ , Lin Yong-ping¹ , Xu Xia¹

1 Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China
2 Department of Gynecology and Obstetrics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Online:2013-06-04 Published:2013-06-04
Contact: Xu Xia, Professor, Master’s supervisor, Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China xuxia503@126.com
About author:Du Jing-chun, Lecturer, Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China hndjc@yahoo.com.cn
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81101730*;
the Grants from the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, No. Y201013*

摘要/Abstract

摘要：

背景：以间充质干细胞为载体的基因治疗新方法具有广阔的应用价值。
目的：利用慢病毒感染方法将肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体导入人羊水来源的间充质干细胞，以期获得稳定表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的人羊水间充质干细胞。
方法：首先利用多位点Gateway技术构建慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，将该表达载体与慢病毒包装质粒同时转染293FT细胞，从而获得携带肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒颗粒。利用重组慢病毒颗粒感染人羊水间充质干细胞，并通过抗生素筛选的方法获得稳定表达目的基因-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的羊水间充质干细胞，并对其稳定性进行鉴定。
结果与结论：酶联免疫吸附法和Western blot检测结果表明，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在感染的人羊水间充质干细胞内呈高表达，其表达量可达到72 μg/L。说明实验成功制备了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 人羊水间充质干细胞, 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体, 基因修饰, 慢病毒载体, 多位点, 稳定表达, 目的基因, 293FT细胞, 组织工程, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The new gene therapy with mesenchymal stem cells as carriers has wide application value.
OBJECTIVE: To import tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand into human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells using lentiviral vector, in order to obtain human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells that stably express tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand.
METHODS: The lentiviral expression vector pLVpuro/EF1α-tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand was constructed by multisite Gateway technique. The expression vector and the lentiviral packaging plasmid were co-transfected with 293FT cells to obtain the lentiviral plasmid carrying tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. The human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells were transfected with recombinant lentivirus particles, and then the human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells that stably express target gene-tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand were obtained by using antibiotic screening methods. The stability of human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells was detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The enzyme-linked immunosorbent assay and western blot results indicated that the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand protein could be highly expressed in the transfected human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells, and the concentration of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand protein could reach 72 μg/L. These results suggest that the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand modified human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells are established successfully.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells, tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, gene modification, lentivirus vector, multi-site, stable expression, target gene, 293FT cell, tissue engineering, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

杜晶春，朱蕊，范婷婷，王鹏鲲，林勇平，徐霞. 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(23): 4272-4278.

Du Jing-chun, Zhu Rui, Fan Ting-ting, Wang Peng-kun, Lin Yong-ping, Xu Xia. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand modified human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(23): 4272-4278.

图/表（结果） 7

2.1 入门克隆pDown-TRAIL的鉴定结果 挑取经BP重组反应并转化感受态细菌后得到的单克隆菌落，经菌落PCR扩增鉴定目的基因片段大小约900 bp，如图1所示，其结果与理论数值一致。为保证其编码氨基酸残基序列的正确性，将经PCR鉴定正确的阳性克隆通过核苷酸测序的方法进一步进行验证，测序结果表明入门克隆pDown-TRAIL构建成功。

2.2 表达载体pLVpuro/EF1α-TRAIL的鉴定 随机挑取通过LR重组反应和克隆转化获得的单克隆菌落，分别采用不同的引物组合行菌落PCR扩增目的基因TRAIL和启动子EF1α和目的基因TRAIL的片段组合，凝胶电泳结果显示，经LR重组反应得到的目的序列大小与预期一致，并且片段插入方向也完全正确，见图2。

2.3 慢病毒的包装与浓缩结果 分别将表达质粒pLVpuro/EF1α-TRAIL和pLVpuro/EF1α-EGFP与Vira PowerTM Lentiviral Packaging Mix共转染293FT细胞48 h后，在荧光显微镜下观察可见转染pLVpuro/ EF1α- EGFP组中大量293FT细胞呈绿色和多核复合体状态，见图3。提示质粒转染进入细胞效率较高，同时细胞在病毒作用下融合状态较好，有利于病毒颗粒的组装和释放。经低温高速离心后，在离心管底可见白色沉淀物，为浓缩后的病毒颗粒。

2.4 人羊水间充质干细胞的获得和鉴定结果 经贴壁培养法获得的人羊水间充质干细胞呈长梭形，在成骨成脂诱导条件下，能形成明显的脂肪滴和钙结节，见图4。

2.5 慢病毒转染人羊水间充质干细胞形态 分别将携带TRAIL和EGFP基因的慢病毒颗粒转染人羊水间充质干细胞，通过两三次次反复感染的方法能够得到转导效率较高的工程细胞，如图5所示，EGFP组在转导2次后细胞高表达绿色荧光蛋白。在转染后的六七天开始用嘌呤霉素进行筛选，期间细胞可能需要传代，经过两三轮筛选后一般可以得到稳定表达目的基因的工程细胞。

2.6 TRAIL修饰的人羊水间充质干细胞的鉴定结果 分别利用ELISA和Western Blot的方法对所获得的工程细胞表达目的基因的效率和稳定性进行鉴定，如图6所示，检测经嘌呤霉素筛选后传代至第3代和第5代的细胞培养液上清可见每组细胞都能够分泌表达目的基因TRAIL，其浓度可达到72 μg/L，并且每组间浓度无明显差异；Western Blot的结果也同样说明了TRAIL在转化TRAIL组呈高表达状态，见图7。

参考文献

[1]Cotrim AP, Baum BJ. Gene therapy: some history, applications, problems, and prospects. Toxicol Pathol. 2008; 36(1):97-103.

[2]Chen YS, Li HR, Miao Y, et al. Local injection of lentivirus-delivered livinshRNA suppresses lung adenocarcinoma growth by inducing a G0/G1 phase cell cycle arrest. Int J Clin Exp Pathol. 2012;5(8):796-805.

[3]Rossmiller B, Mao H, Lewin AS. Gene therapy in animal models of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Mol Vis. 2012;18:2479-2496.

[4]Dewey RA, Morrissey G, Cowsill CM, et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 1999;5(11):1256-1263.

[5]Raper SE, Chirmule N, Lee FS, et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 2003;80(1-2):148-158.

[6]Lin CS, Ning H, Lin G, et al. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? Cytotherapy. 2012;14(10): 1159-1163.

[7]Lee RH, Kim B, Choi I, et al. Characterization and expression of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 2004;14(4-6):311-324.

[8]Chamberlain G, Fox J, Ashton B, et al. Concise review: meshenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 2007;25(11):2739-2749.

[9]Bartholomew A, Sturgeon C, Siatskas M, et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 2002;30(1): 42-48.

[10]Khakoo AY, Pati S, Anderson SA, et al. Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi's sarcoma. J Exp Med. 2006;203(5):1235-1247.

[11]Kidd S, Spaeth E, Dembinski JL, et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells. 2009;27(10):2614-2623.

[12]Gao Y, Yao A, Zhang W, et al. Human mesenchymal stem cells overexpressing pigment epithelium-derived factor inhibit hepatocellular carcinoma in nude mice. Oncogene. 2010; 29(19):2784-2794.

[13]Kucerova L, Altanerova V, Matuskova M, et al. Adipose tissue-derived human mesenchymal stem cells mediated prodrug cancer gene therapy. Cancer Res. 2007;67(13): 6304-6313.

[14]Seo SH, Kim KS, Park SH, et al. The effects of mesenchymal stem cells injected via different routes on modified IL-12-mediated antitumor activity. Gene Ther. 2011;18(5): 488-495.

[15]Ling X, Marini F, Konopleva M, et al. Mesenchymal stem cells overexpressing IFN-βinhibit breast cancer growth and metastases through Stat3 signaling in a syngeneic tumor model. Cancer Microenviron. 2010;3(1):83-95.

[16]Los M, Panigrahi S, Rashedi I, et al. Apoptin, a tumor-selective killer. Biochim Biophys Acta. 2009;1793(8): 1335-1342.

[17]Li X, Liu Y, Wen Z, et al. Potent anti-tumor effects of a dual specific oncolytic adenovirus expressing apoptin in vitro and in vitro. Mol Cancer. 2010;9:10.

[18]Duiker EW, Mom CH, de Jong S, et al. The clinical trail of TRAIL. Eur J Cancer. 2006;42(14):2233-2240.

[19]Ashkenazi A, Pai RC, Fong S, et al. Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand. J Clin Invest. 1999;104(2):155-162.

[20]State Council of the People's Republic of China. Administrative Regulations on Medical Institution. 1994-09-01.

[21]Li YT, Chen SY, Wang CR, et al. Brief report: amelioration of collagen-induced arthritis in mice by lentivirus-mediated silencing of microRNA-223. Arthritis Rheum. 2012;64(10): 3240-3245.

[22]Luche RM, Enssle J, Kiem HP. Abrogated cryptic activation of lentiviral transfer vectors. Sci Rep. 2012;2:438.

[23]Kafri T, van Praag H, Gage FH, et al. Lentiviral vectors: regulated gene expression. Mol Ther. 2000;1(6):516-521.

[24]Gallay P, Hope T, Chin D, et al. HIV-1 infection of nondividing cells through the recognition of integrase by the importin/karyopherinpathway. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94(18):9825-9830.

[25]Ueda S, Yoshikawa M, Ouji Y, et al. Cynomolgus monkey embryonic stem cell lines express green fluorescent protein. J Biosci Bioeng. 2006;102(1):14-20.

引言

基因治疗方法已在多种疾病如恶性肿瘤、遗传性疾病和自身免疫性疾病的治疗研究中显示了较好的应用前景^[1-3] 。目前研究中常用的基因治疗用载体大多数是一些经过改装的病毒载体。然而病毒载体的一个严重缺点是其本身有可能诱发机体产生针对病毒成分的免疫反应从而导致预期的治疗失败甚至死亡^[4-5] 。因此选择合适的基因载体就成为目前基因治疗前首先要解决的关键问题。
间充质干细胞作为一种多能干细胞，具有来源广泛和取材方便的显著优势^[6-7] 。更为重要的是由于间充质干细胞本身低表达甚至不表达主要组织相容性分子和某些共刺激分子从而具有低免疫原性，并因此在进入同种异体后不发生排斥反应而容易被宿主接受^[8-9] ，同时间充质干细胞还具有特异性向肿瘤组织迁移的特点，如Khakoo等^[10]报道通过尾静脉进入小鼠体内的人骨髓来源的间充质干细胞能够到达皮下形成的卡波西肉瘤组织，Kidd等^[11]运用活体内生物发光跟踪技术清晰直观的记录了间充质干细胞向肿瘤组织选择性趋化的特性。目前利用间充质干细胞作为基因治疗载体的新策略已经展示了较好的预期效果。如Gao等^[12]利用慢病毒包装系统制备的色素上皮衍生因子修饰的骨髓来源间充质干细胞在体内体外实验中均展示了较好的抑制肝癌细胞生长和转移的能力。Kucerova等^[13]联合利用胞嘧啶脱氨酶修饰的脂肪来源间充质干细胞和前体药物5-氟胞嘧啶有效抑制了体内肿瘤模型中大肠癌的发展。Seo等^[14]报道白细胞介素12修饰的间充质干细胞能够明显的激活小鼠体内肿瘤特异性的T-淋巴细胞反应和抗肿瘤效应, Ling等^[15]的结果表明β-干扰素修饰的间充质干细胞能够在具有正常免疫系统的小鼠体内抑制乳腺癌细胞的增殖和转移。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)属于肿瘤坏死因子家族成员之一，不同于该家族其他成员的是TRAIL只是特异性诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞的生长和增殖却无影响^[16-17] 。基因重组的TRAIL蛋白在体外具有很好的抑制肿瘤增殖的活性，但是在进入体内后由于半衰期太短，所需剂量过大，易引起免疫耐受等原因而导致其体内效果并不理想^[18-19] 。如何克服直接以蛋白质方式给药的缺陷成为提高TRAIL疗效的一大瓶颈，与直接蛋白给药相比，利用合适的细胞载体采用基因给药的方式向病灶部位持续稳定的输入目的蛋白能够避免这一弊端，并可以提高局部药物浓度，有望进一步提高TRAIL的治疗效果。为此，实验将间充质干细胞的细胞载体优势和TRAIL的特异性诱导肿瘤细胞凋亡的优势结合起来，利用多位点Gateway技术和慢病毒转染的方法制备稳定表达TRAIL蛋白的人羊水来源间充质干细胞，为下一步实现靶向抑制肿瘤生长奠定基础。

材料方法

设计：分子生物学及细胞学实验。
时间及地点；实验于2011年3月至2012年5月在广州医学院检验系实验室完成。
材料：
人羊水来源间充质干细胞：在广州医学院临床产前诊断正常标本中收集羊水组织进行实验。根据中华人民共和国国务院颁发的《医疗机构管理条例》^[20]，在实验前将实验方案和风险告知对方，并签署知情同意书。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞的制备和鉴定的主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法；
入门克隆pDown-TRAIL的构建和鉴定：根据NCBI数据库中TRAIL基因的cDNA序列，利用Primer软件设计上下游分别含有attB1和attB2位点的特殊引物，具体序列为：

CR扩增：以从广州英俊基因有限公司合成的TRAIL基因的cDNA序列为模板，用上述引物按95 ℃变性30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环的PCR条件扩增目的基因，并采用琼脂糖凝胶电泳后切胶回收的方法纯化目的基因-TRAIL。
BP重组反应：将上述回收PCR产物与入门载体pDONRTM221按试剂盒操作说明做重组反应。取1 μL反应产物转化Stbl3感受态大肠杆菌，均匀涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB培养板上，置于37 ℃培养箱过夜培养。从上述培养板挑单克隆菌落于含50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃ 220 r/min条件下培养15 h后，做菌落PCR鉴定，并提取阳性克隆质粒进一步做测序分析。
pLVpuro/EF1α-TRAIL表达载体的构建和鉴定：将入门质粒pUp-EF1α和pDown-TRAIL与目的载体pLV.Des2d混合后加入LR重组反应酶，在25 ℃条件下反应16 h后，取1.5 μL反应产物转化50 μL Stbl3感受态大肠杆菌，均匀涂布于含质量浓度80 mg/L氨苄西林的LB培养板上，挑取单克隆菌落扩增后，通过菌落PCR的方法鉴定阳性克隆。
pLVpuro/EF1α-TRAIL慢病毒颗粒的制备：首先将293FT细胞接种于10 cm大小的培养皿中，待细胞融合度达90%以上时，将培养基换成不含抗生素的293FT培养基后，分别在一含1.5 mL Opti-MEM 培养基的离心管中加入 9 μg ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix和3 μg上述构建的表达载体，轻轻混匀；向另一含1.5 mL Opti-MEM培养基的离心管中加入36 μL LipofectamineTM 2000，轻轻混匀后室温放置5 min；将上述2管溶液轻轻混匀，室温孵育20 min后，加入到含293FT细胞的培养皿中，小心置于细胞培养箱中，8 h后换成新鲜的293FT培养基，48 h后收集含病毒颗粒的培养上清，短暂离心除去细胞碎片后，将病毒上清液用0.45 μm滤器过滤，并在4 ℃ 75 000×g高速离心90 min收集病毒颗粒，分装后，置于-80 ℃低温冰箱中备用。
羊水间充质干细胞的制备和鉴定：将收集的羊水组织，经1 100 r/min，离心5 min弃上清后，将细胞沉淀重悬后，种在低糖DMEM培养液中，通过贴壁培养的方法连续传代二三代后即可获得形态均一的间充质干细胞，通过体外成骨成脂诱导分化方法鉴定所获得的间充质干细胞的干细胞特征。
慢病毒转导人羊水间充质干细胞：取第4或5代状态较好的间充质干细胞，换成新鲜培养液后，按50∶1的体积比加入事先制备好的pLVpuro/EF1α-TRAIL慢病毒颗粒和polybrene (6 mg/L)，感染12 h后去除含病毒的培养液，换为新鲜低糖-DMEM培养液继续培养12 h，如此反复，可以连续感染二三次以达到较好效果。同时，为了监测转染效率平行准备pLVpuro/EF1α-EGFP慢病毒包装颗粒并按上述方法同时感染同批次来源的间充质干细胞。
转染后间充质干细胞的纯化：为了得到稳定表达TRAIL的感染细胞，在转染后的第4天开始用质量浓度1-3 mg/L的嘌呤霉素进行筛选，一般需要经历两三轮的筛选，同时在筛选的过程中，根据细胞的增殖情况可能需要传代培养。
转染后间充质干细胞的鉴定分析：分别收集对照组(转染EGFP组)和实验组(转染TRAIL组)的培养液上清和细胞。所获得的上清液按TRAIL的ELISA检测试剂盒说明书要求检测每组上清液中TRAIL的浓度；各组细胞成分经裂解，离心后通过SDS-PAGE电泳分离和电转移后，经抗TRAIL抗体孵育过夜，洗膜，HRP标记的二抗(Abcam公司)常规孵育1.0-2.0 h后，再洗膜后，ECL发光底物反应2-4 min，暗室显影成像后，通过显色条带比较转染TRAIL组和转染EGFP组中TRAIL蛋白表达量的差异。
主要观察指标：入门克隆和表达克隆的构建正确与否；慢病毒包装的效果；pLVpuro/EF1α-TRAIL慢病毒颗粒感染人羊水间充质干细胞后TRAIL的表达效率。
统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析，组间均数差异的比较采用两样本t 检验，P < 0.01表示差异有显著性意义。

讨论

实验选择人羊水来源的间充质干细胞做为肿瘤基因靶向治疗的细胞载体，相对于从骨髓和脂肪组织获取间充质干细胞，从羊水组织获取间充质干细胞具有取材相对方便和干细胞比率相对高的优势。从实验结果中可见人羊水来源的间充质干细胞具有较强的增殖能力和体外诱导分化能力，同时由于该类细胞具有低免疫原性和向肿瘤组织迁移的特点，目前利用间充质干细胞做为细胞载体用于肿瘤治疗的基因治疗研究已经在体外和动物水平取得了较好的效果^[12-13] 。
实验首先运用多克隆位点技术将肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因成功引入慢病毒表达载体中，这为高效导入间充质干细胞并获得TRAIL修饰的间充质干细胞提供了前提。
如何能将外源基因高效地导入目的细胞并在其中有效稳定的表达是基因靶向治疗研究的热点问题。在众多转基因方法中, 慢病毒载体法有着其他转基因技术方法如电穿孔法和化学试剂介导法不可比拟的优势^[21-22] 。以获得性免疫缺陷病毒1病毒为基础改良的新型基因修饰用载体工具－慢病毒载体，可以感染分裂型和非分裂型细胞，其宿主广泛，可在体内将目的基因高效稳定整合到基因组DNA，且无多次复制能力等优点^[23-25] 。
慢病毒载体颗粒的组装需要病毒包装质粒(商品化)和表达质粒(自行构建)同时感染293FT细胞，实验中采用多位点Gateway技术通过两步反应成功构建了表达质粒pLVpuro/ EF1α-TRAIL。相比传统的重组质粒构建方法，该方法是一种位点特异性的DNA重组技术，它整合了各种载体的技术平台，克服了传统的酶切和连接方法构建载体的种种缺陷，能够将目的基因高效地克隆到一个或多个与Gateway技术兼容的载体系统中，在载体构建的整个过程中不需要限制性内切酶及连接酶处理环节，简化了实验过程，提高了实验效率，该方法具有通用性强，且能保持基因定位和DNA读码框不发生改变的优势。
为了监测质粒的转导效率和慢病毒包装载体293FT细胞的融合情况，实验在转化表达质粒pLVpuro/EF1α-TRAIL的同时，平行做了转化对照表达质粒pLVpuro/EF1α-EGFP。这样就可以通过荧光显微镜观察病毒的包装情况，从实验结果中可以看到在慢病毒结构蛋白的作用下，293FT细胞融合状态良好，其转染率达到了90%，这为获得较高产量的慢病毒颗粒提供了保证。重组病毒颗粒对载体细胞的高效感染是获得稳定表达目的基因细胞载体的关键。为此，实验同时做了重组增强绿色荧光蛋白修饰人羊水间充质干细胞的阴性对照，从图5的结果中可见转导EGFP组的靶基因转导效率达到了90%以上，该结果也间接反应了转导TRAIL组的转导效率在理论上应该达到了90%左右，但是其准确的转导效率仍需要通过检测目的蛋白的表达效率的方法来做进一步的确认。
基因修饰的间充质干细胞要达到治疗目的的首要前提是其必须能够长期稳定高效的表达目的基因。为了进一步确认实验中获得的转导了TRAIL的人羊水间充质干细胞在经过抗生素嘌呤霉素筛选后能否长期表达目的蛋白，分别在经过嘌呤霉素筛选后的TRAIL修饰的人羊水来源间充质干细胞传代至第3，5代时收集相应的培养上清液和部分间充质干细胞，利用ELISA和western blot的方法检测TRAIL蛋白的表达情况。检测结果表明TRAIL基因已稳定整合进入细胞基因组DNA中并可以高效表达成分泌蛋白，其体外培养上清浓度可以达到约72 μg/L，这为下一步研究TRAIL修饰的人羊水来源间充质干细胞是否具有抑制肿瘤细胞生长奠定了基础。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞

Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand modified human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.